Restriktionsenzyme arbeiten nach einem einfachen Prinzip: Sie schneiden DNA an ganz bestimmten Sequenzen in zwei Teile. Diese Sequenzen sind typischerweise Palindrome (Ein Palindrom liest sich vorwärts wie rückwärts gleich. Also zum Beispiel GAATTC, dessen Tochterstrang CTTAAG wäre).

Die Enzyme schneiden in zwei Varianten:

1. Sie schneiden gerade und es entstehen sogenannte "blunt ends". Diese sind nicht so reaktiv und werden zum dauerhaften Trennen von DNA verwendet. Sie finden z.B. Einsatz bei dem Vaterschaftstest.
2. Sie schneiden in einem Treppenmuster, also nicht gerade, sondern schräg, sodass auf beiden Seiten Basen frei liegen. Diese Enden sind sehr reaktiv und werden auch als "sticky ends" bezeichnet. Sie finden z.B. Einsatz bei dem Gentransfer.

Die Funktion von Restriktionsenzymen sollte jedem geläufig sein, da sie als Definition abgefragt werden kann.