Die oxidative Decarboxylierung ist der zweite Schritt des Glukoseabbaus und findet in der Matrix der Mitochondrien statt. Um diesen Schritt zu ermöglichen, muss das Pyruvat aus der Glykolyse zuerst in die Mitochondrien transportiert werden. Auch bei diesem Schritt gibt der Name schon Auskunft über die stattfindenden Abläufe.

Wichtig ist hierbei zu verstehen, dass zuerst die Decarboxylierung (die Abspaltung von CO₂) stattfindet, bevor die übrig gebliebene Hydroxygruppe abgespalten werden kann. Somit ist es eher eine Decarboxylierung mit anschließender Oxidation als eine oxidative Decarboxylierung.

1. Die oxidative Decarboxylierung findet an einem großen Multienzymkomplex, der Pyruvatdehydrogenase (PDH), statt. Diese besteht aus drei Enzymen (E1-E3) und benötigt zum Ausführen ihrer Arbeit noch einige Coenzyme wie das Vitamin Thiamin, NAD⁺, FAD, Liponamid und das Coenzym A. Liegen all diese Coenzyme vor, kann die PDH mit der Arbeit beginnen, indem sie mit ihrem ersten Enzym Pyruvat bindet und die Carboxylgruppe abspaltet. Durch das Abspalten der CO₂-Gruppe liegt jetzt ein C2-Körper mit Hydroxygruppe vor.
2. Im nächsten Schritt kann der C2-Körper auf ein Schwefelatom des Liponamid des zweiten Enzyms der PDH übertragen werden. Durch diese Übertragung findet die Oxidation des C2-Körpers statt. Anschließend kann dieser C2-Körper weiter auf das Coenzym A übertragen werden und es entsteht Acetyl-CoA.
3. Liponamid wurde durch Aufnahme von Wasserstoffatomen des C2-Körpers reduziert. Diese Wasserstoffatome können in einem letzten Schritt von Liponamid auf FAD übertragen werden. Dieses FAD wird zu FADH₂ und überträgt die Wasserstoffatome wiederum auf das mobile NAD. Dies kann als NADH+H⁺ anschließend in die Atmungskette eingeschleust werden.