Unter Glukoneogenese wird die Synthese von Glukose aus organischen Nicht-Kohlenhydratvorstufen verstanden. Wie bereits beschrieben, ist diese Reaktion essenziell, um Erythrozyten, Zellen des Nierenmarks und des Nervensystems auch in Fastenphasen mit Glukose zu versorgen. Aufgrund der enzymatischen Ausstattung findet die Glukoneogenese fast ausschließlich in der Leber und den Nieren statt. Von dort werden die synthetisierten Glukosemoleküle in das Blut abgegeben.

Bis auf einige Ausnahmen wird die Glukoneogenese von denselben Molekülen synthetisiert, die auch an der Glykolyse beteiligt sind. In diesem Fall liegt jedoch Pyruvat als Ausgangssubstanz vor und es wird Glukose synthetisiert.

Die Nicht-Kohlenhydratvorstufen, aus denen die Glukosemoleküle synthetisiert werden, umfassen:

1. Laktat: Dieses Stoffwechselprodukt entsteht, wenn bei der Glykolyse nicht ausreichend Sauerstoff zur Verfügung steht. Laktat kann in den Leberzellen zu Pyruvat umgewandelt werden und für die Glukosesynthese genutzt werden.
2. Glycerin: Glycerin entsteht durch die Spaltung von TAG und kann in den Leberzellen zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat umgewandelt und in den Stoffwechselweg der Glukoneogenese eingeschleust werden.
3. Aminosäuren: Einige Aminosäuren können durch Abspaltung der Aminogruppe zu Pyruvat oder anderen Zwischenprodukten des Citratzyklus umgewandelt werden. Diese Zwischenprodukte können zu Oxalacetat verstoffwechselt werden, welches wiederum zu Phosphoenolpyruvat, einem Zwischenprodukt der Glukoseneogenese, umgebaut werden kann. Die Aminosäuren stammen zum größten Teil aus extrahepatischem Gewebe und werden hauptsächlich aus der Muskulatur freigesetzt. Daher wird im Hungerzustand streng genommen Muskeleiweiß abgebaut, um die Synthese von Glukosemolekülen zu ermöglichen.